Принципы и методы окраски гистологических препаратов. Базофилия, оксифилия
В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.
Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах.
Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде.
Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.
Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа:
Тип красителя | Пример | Окрашиваемые структуры |
Кислые красители | Кислоты и кислые соли : -эозин -кислый фуксин. | а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям). б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна). |
Основные красители | Основные соли : -гематоксилин -азур 2, кармин. | а) Красящиеся структуры – базофильные (сродство к основным красителям). б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами · ядра, · рибосомы, · аморфный компонент межклеточного вещества. |
Нейтральные красители | Смесь двух красителей: основного (азур 2) и кислого (эозин). | а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; пример – специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах. б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2. |
2. Рыхлая волокнистая с/ткань:много клеток, мало межклеточного вещества (волокон и аморфного вещества). Локализация: образует строму многих органов, адвентициальная оболочка сосудов, располагается под эпителиями – образует собственную пластинку слизистых оболочек, подслизистую основу, располагается между мышечными клетками и волокнами.
Клетки: фибробласты (5 разновидностей: юные, зрелые, фиброциты, миофибробласты, фиброкласты; образуются из малодифференцированных клеток мезенхимы; отростчатые клетки с небольшим количеством цитоплазмы; функции – образование коллагеновых и эластических волокон, аморфного вещества соединительной ткани, образование ферментов, разрушающих волокна и аморфное вещество – коллагеназы, эластазы, гиалуронидазы, синтез биологически-активных веществ ),макрофаги (образуются из моноцитов крови), тучные клетки, и др.
3. Печень: источники развития, особенности кровообращения. Классическая печеночная долька. Портальная долька. Ацинус.
СТРОМА капсула, межсегментарная и междольковая соединительная ткань
капсула образована плотной волокнистой соединительной тканью покрыта серозной оболочкой
межсегментарная и междольковая соединительная ткань представлена рыхлой соединительной тканью
ПАРЕНХИМА образована печеночными дольками
долька печени представляет собой шестигранную призму, основу которой образуют гепатоциты, расположенные тяжами
Кроме гепатоцитов в состав дольки входят:
· звездчатые клетки (клетки Ито, липоциты), имеющие множество отростков и содержащие в цитоплазме липидные включения с витамином А; эти клетки имеют мезенхимальное происхождение и являются аналогами фибробластов; они могут активироваться и превращаться в миофибробласты; они участвуют в процессах роста и пролиферации гепатоцитов, развитии цирроза, регулируют кровоток в синусоидных капиллярах и ток желчи в желчных капиллярах
· триады печени проходят вокруг дольки, состоят из ветвей печеночной артерии, воротной вены и желчного протока
· внутридольковые желчные капилляры начинаются слепо в центральных отделах дольки и идут к периферии дольки, где впадают в вокругдольковый желчный проток, желчь по ним течет от центра к периферии дольки; внутридольковый желчный капилляр не имеет собственной стенки, а образован мембранами соседних гепатоцитов, или другими словами, представляет собой узкую щель между гепатоцитами
· внутридольковые синусоидные капилляры, которые образуются за счет слияния вокругдольковых артерии и вены (ветви печеночной артерии и воротной вены), и которые идут между гепатоцитами от периферии к центру дольки и впадают в центральную вену, кровь по этим синусоидам течет от периферии к центру дольки; между капилляром и гепатоцитами имеется перисинусоидное пространство (пространство Диссе)
· центральная вена располагается в центре дольки, принимает кровь из внутридольковых синусоидных капилляров
Все дольки соединены между собой междольковой, межсегментарной соединительной тканью
Строение стенки внутридолькового синусоидного капилляра
· фенестрированный эндотелий, к которому прикреплено большое количество макрофагов(клетки Купфера),
· базальная мембрана отсутствует, имеется небольшое количество ретикулярных волокон
· образуется за счет слияния вокругдольковых артерии и вены
· идет от периферии к центру дольки, где впадает в центральную вену
· перисинусоидное пространство (Диссе) представляет собой щель между стенкой синусоидного капилляра и гепатоцитами, здесь также находятся звездчатые клетки (клетки Ито)
ИСТОЧНИКИ РАЗВИТИЯ
мезенхима – капсула и прослойки соединительной ткани, звезчатые клетки
энтодерма – гепатоциты, эпителий желчных протоков;
костный мозг – клетки Купфера
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 |
19
| 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 |
Источник: https://studall.org/all3-2763.html
Рабочая классификация красителей, используемых в биологической микроскопии
Существует немало рабочих классификаций красителей, использующихся в биологии. При изложении материала авторы редко придерживаются чёткого разделения. Обычно различают четыре больших группы красителей:
- Основные (или ядерные) красители. Они избирательно окрашивают ядра клеток и базофильные структуры. Кстати, сам термин «базофильный» появился по названию этой группы красителей, так как в переводе с латинского basis — основной.
- Кислые (или цитоплазматические) красители. Окрашивают преимущественно цитоплазму, реже клеточные стенки и тому подобного.
- Нейтральные красители. К этой группе, по нашему мнению, должны быть отнесены и такие красители, которые избирательно окрашивают компоненты цитоплазмы, например, судан III или нильский синий, окрашивающие капельки жира.
- Флюорохромы. Группа красителей, способных флюоресцировать при той или иной длине волны возбуждающего света. Несмотря на то, что мы выделили эти красители в самостоятельную группу, большинство из них следовало бы отнести к цитоплазматическим или, реже, к ядерным красителям.
Ядерные красители
Ядерные красители представляют собой едва ли не самую многочисленную группу красителей вообще. Основная цель обработки данными веществами состоит в том, чтобы выявить материал, близкий к ДНК или РНК. По механизму окрашивания ядерные красители делят на две группы, принципиально отличающиеся друг от друга. Это основные красители и протравные красители.
Основные красители
Применение основных красителей (все они являются «катионными») основано на образовании соединений типа солей в присутствии ДНК или РНК.
- Азокрасители:— янус зелный В;
— бисмарк коричневый.
- Сафранины:— сафранин Т;— сафранин А;— сафранин О;
— феносафранин.
- Оксазиновые красители:— бриллиантовый крезиловый синий;
— крезиловый прочный фиолетовый.
- Тиазины:— тионин;— азуры С, А, В;— метиленовый синий;
— толуидиновый синий.
- Трифенилметановые:— пара-розанилин;— кристаллический фиолетовый;— метиловый фиолетовый;— метиловый зелёный;
— альциановый синий;
Протравные красители
В основу методик применения протравных красителей легла способность ряда соединений образовывать ярко окрашенные лаки с ионами металлов — лития, железа, хрома. В эту группу входят:
- Наиболее известные и используемые красители:— гематоксилин;— кармин (карминовая кислота);— ализарин-цианин;— ализарин;— бразиллин;
— галлоцианин.
- Малоизвестные и редко применяющиеся красители:— пурпурин;— ализариновый синий;— ализариновый чёрный;— ализариновый зелёный;— антрапурпурин;— хинализарин;— чисто-синий В;
— антраценовый синий.
В зависимости оттого, ион какого металла входит в состав протравного реагента, конечный цвет окраски может меняться от красного до зеленовато-чёрного. Примеры такой зависимости приведены в таблице.
Ализарин | красный | — | — |
Пурпурин | красный | — | — |
Кармин (карминовая кислота) | красный | — | — |
Бразилин | красный | серо-коричневый | зеленовато-чёрный |
Гематоксилин | синий | серо-синий | серо-чёрный |
Галлоцианин | — | синий | серо-чёрный |
Антраценовый синий | — | синий | серо-чёрный |
Цитоплазматические красители
Эта группа красителей представлена большей частью сульфоновыми и карбоновыми кислотами, которые в тканях прочно связываются с белками и в результате окрашивают большинство внеядерных структур:
- эозин;
- аурамин О;
- эритрозин;
- родамин В;
- родамин 3G;
- родамин 6G;
- пиронин G;
- акрифлавин;
- флюоресцеин;
- акридиновый оранжевый;
- конго красный;
- акридиновый жёлтый;
- криофосфин;
- нейтральный красный;
- толуидиновый синий.
Цитоплазматические красители в сочетании с фосфорно-вольфрамовой кислотой, фосфорно-молибденовой кислотой могут окрашивать специфические структуры клеток и тканей, например, коллаген.
В большинстве методик цитоплазматические красители используются для контраста после окраски ядерными красителями.
Несколько реже прибегают к такому свойству цитоплазматических красителей, как способность окрашивать живые клетки без нарушения функций последних (так называемые витальные красители); в таких методиках применяют очень большие разведения красителей — от 1:1000 до 1:20000.
Нейтральные красители
Группа нейтральных красителей невелика. Например, важное практическое значение имеют красители, окрашивающие жиры:
- судан III;
- судан IV;
- судан чёрный;
- нильский синий.
Флюорохромы
Флюорохромы в данной классификации стоят особняком, потому что эта группа включает и кислые, и основные красители.
Главной отличительной чертой всех этих соединений является способность излучать свет определённой длины волны под воздействием лучей ультрафиолетового, фиолетового и синего спектра.
Молекула красителя, поглотив квант падающего света, испускает световое излучение большей длины волны, чем длина волны падающего света. Так, например, флюоресцеин, поглощая свет с длиной волны 420-490 нм, излучает свет с длиной волны 520-540 нм.
При этом объекты, окрашенные флюоресцеином в люминесцентном микроскопе, светятся зелёным светом.
Некоторые области применения флюорохромов приведены в таблице.
Ядро (ДНК/РНК) | Акридиновый оранжевый | Голубой свет (420-490 нм) | 520 нм |
Пропидиум иодид | Зелёный (530-560 нм) | 580 нм | |
Этидиум бромид | Зелёный (530-560 нм) | 580 нм | |
Хромомицин А | Голубой свет (420-436 нм) | 490 нм | |
Акрифлавин | Голубой свет (420-436 нм) | 490 нм | |
Хёхст 33258 | Ультрафиолет (340-380 нм) | 430 нм | |
Пиронин G | Зелёный (530-560 нм) | 580 нм | |
Берберин сульфатКориофосфин О Фосфин 3R | — | — | |
Внутриклеточные жиры | Нильский красный | Голубой свет (450-490 нм) | 520 нм |
Эозин Б | Зелёный (530-560 нм) | 580 нм | |
Белки/гистоны | Эозин Б | Зелёный (530-560 нм) | 580 нм |
Тиазиновый красный Р | Зелёный (530-560 нм) | 580 нм | |
Сульфофлавин | Ультрафиолет (340-380 нм) | 430 нм | |
Внутриклеточный кальций | Индо 4 | — | — |
Митохондрии | Родамин 123 | — | — |
Тромбоциты | Мепакрин | 355 нм | 425 нм |
Бактерии | Акридиновый оранжевый | Голубой свет (420-490 нм) | 520 нм |
Источник: http://www.ysam.ru/class.html